人脂肪間充質干細胞（國家干細胞資源庫）

人脂肪間充質干細胞培養基

貼壁 呈梭形

細胞培養的原理和步驟，簡單好用以及精確！

今天我們要講解的是，細胞培養的原理和步驟，簡單好用以及精確，學完之后，相信你對細胞培養將不再陌生。接下來就開始今天的學習吧！

細胞培養:體外模擬體內需要的生長條件（溫度，營養等），然后加上一些處理條件，比如做藥物篩選，就可以做抗性基因的表達的篩選，比如還可以測定某個基因敲低或是過表達的產物，這個當然要結合WB來看最后基因的表達產物是否升高哦，細胞培養的應用還有很多。

細胞培養的基本原理：細胞傳代（生存空間和營養不足，長得太密，代謝廢物太多，要洗洗，同時也要分離出一部分細胞，要加入新的培養液），換液（生存空間和營養剩余，但是代謝廢物太多，要洗洗，要吃飯，才能長好，所以要洗和加入新鮮培養基），凍存（太多了，先存起來，液氮里面里就是低溫，保存能量，活得久），復蘇（解凍，恢復吃飯的能力，恢復生長。）這四步。

細胞培養的基本步驟（一定要明白每個步驟的意義和目的）：

01細胞傳代（貼壁細胞）：

試劑：PBS,胰mei，含血清的培養基；

流程：顯微鏡下看一看培養皿里的細胞多不多，太多（80%~90%）會導致代謝廢物很多，先吸掉廢液，再用PBS洗一洗，同時太多會導致細胞黏在一起，這時候就需要加點胰mei消除它們之間的粘性，是否消除完，在顯微鏡下看一看，看完加入適宜的含血清的培養基，中和一下胰mei，這叫吹打，除此之外，細胞太多了，把一部分細胞移出來，加入適量的培養基放入孵箱繼續培養，這叫傳代。

02細胞換液：

試劑：PBS，含血清的培養基；

流程：先吸掉代謝廢物（即細胞瓶中的培養液），再用PBS洗一洗，由于細胞長得不是很多，細胞之間沒有黏在一起，因此不需要加入胰mei來消除它們之間的粘性。由于細胞要吃飯，加入新鮮的含血清的培養基，最后放到孵箱里面進行培養。

03細胞凍存：

試劑：凍存液，PBS，胰mei，含血清的培養基；

流程：要凍存，先配置凍存液，凍存液包含了：DMSO：防止在低溫（零度以下至-196℃）保存細胞時，細胞內液會形成冰晶，滲透壓會發生改變，細胞結構會出現紊亂，會導致細胞出現損傷。凍存液制備時，一般需與血清一起配置：因為兩者互融時，會散發熱量，所以凍存液需提前制備。

因為細胞太多了，需要凍存，所以要先看一看，吸一吸，洗一洗，分一分，中和一下，吹打制成細胞懸液，離心，吸掉上清液，加入凍存液，輕輕吹吸均勻，每管等量1ml裝入凍存管，4℃20min,-20℃30min,-80℃過夜，最后放入液氮罐。

04細胞復蘇：

試劑：含血清的培養基；

流程：從液氮中取出凍存管，迅速（小于3min）置于37℃水浴鍋中，解凍時，邊晃動邊觀察，當看到只有一小塊冰存在時，即可從水浴鍋中取出，打開凍存管，迅速將細胞懸液吸到離心管中，輕輕混勻，1000r/min,離心五分鐘，吸掉上清液，沉淀中加入適量培養液，放入孵箱中，培養。還有就是：復蘇的細胞，需要在24小時后，換一次培養液。

最后：在這里特別感謝B站上無私分享的細胞培養的視頻資源，正是你們的分享，幫助了我，我也會繼續把我學到的繼續分享，幫助更多的人！如果大家想要獲得這份視頻資源的話，可以在后臺私聊小編獲取哦，里面關于細胞培養的知識講解的超級詳細！明天我會繼續介紹細胞培養的一些注意事項以及WB的操作的步驟和原理。

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隨著細胞培養技術的不斷發展和普及，細胞培養已經成為細胞學、遺傳學、免疫學、實驗醫學和腫瘤學等多種學科研究的重要工具。然而，要進行一次成功的細胞培養并不是件輕松簡單的事情。

要想在一次細胞培養過程中獲得足量且優質的培養物，通常要做到以下幾點：活力好且無污染的種子細胞；適合該細胞生長的*培養基；安全無污染的試劑耗材；嚴格的無菌操作；完備的細胞培養知識體系。在這幾點當中，有些小的細節往往容易被忽視，快來看看你是否中過招吧！

1.及時保種—未雨綢繆，有備無患：就算是細胞培養經驗再豐富，細胞房條件再好，也無法100%避免微生物污染。一旦培養物發生污染，將會很難補救。所以，在拿到種子細胞后，及時“備份"不失為一種明智之舉。具體做法是：如果拿到的是一瓶密度合適的活細胞（以T25培養瓶為例）--第一次傳代時，一半細胞直接凍存一支保種，剩下一半細胞接種至一個（或多個，比例視細胞增殖速度、細胞類型而定）新的培養瓶；如果拿到的是凍存管--先復蘇至一個培養瓶，待細胞長到傳代密度后，按上面活細胞處理方法保種。這樣一來，可以大大減少培養物還未大量擴增就被污染或狀態差導致無種子可用的尷尬境地啦！

2.PBS的選用：傳代之前需要用PBS洗去殘留培養基是因為其中的Ca+、Mg+會降低胰蛋白mei活性。所以，一定要使用DPBS或者不含Ca+、Mg+的PBS哦！否則可能會出現消化時間變長、消化不*甚至消化不下來細胞的情況。

3. 消化時間的把握：說明書上的消化時間僅供參考，不要*遵循說明書上的消化時間，因為消化時間和細胞密度、胰mei效價甚至細胞狀態有關。要邊消化邊在顯微鏡下觀察（期間不要頻繁晃動培養瓶），把握最佳的消化時間是細胞培養中的重中之重！

4、消化終止液的選用：一般使用2倍胰mei體積的*培養基或者等體積大豆胰蛋白mei抑制劑來終止mei消化作用，但在使用*培養基終止時要注意必須確認該*培養基含有10%FBS。如果該細胞采用無血清培養基培養，要使用等體積大豆胰蛋白mei抑制劑來終止消化。

5.培養基的小細節：培養基能否用來培養你的細胞的關注點除了配方是否合適、是否在保質期內、有無微生物污染以外，還需關注培養基PH值--最直觀的方法是看培養基是否變成紫紅色。如果培養基是紫紅色，說明此時PH偏高，呈堿性。很多細胞對PH值較為敏感（如BV-2，THP-1），偏堿可能導致細胞狀態差甚至凋亡。為了避免出現這種情況，可在接種細胞前將適量培養基裝入培養瓶，然后放入CO2培養箱靜置20Min以調整PH（非透氣瓶要擰松瓶口）。可以這么做的原因是因為絕大多數培養基（L-15培養基除外）都具PH緩沖系統。

6.經常鋪不勻細胞怎么辦：一般使用“十字法"搖勻細胞，但如果把握不好力度和搖晃次數的話很可能無法鋪勻細胞，為自己的實驗或下次傳代帶來不必要的麻煩。解決辦法是：將細胞懸液加入培養瓶后立起培養瓶輕輕吹打培養基2-3次后立即平放入培養箱，在細胞貼壁前不再搬動培養瓶。