細胞名稱：綿羊肺成纖維細胞（原代永生化）

 OAR-L1  

細胞培養條件：DMEM+10%FBS+1%P/S

生長狀態：貼壁生長

細胞是生物學實驗的重要材料，也是生物細胞學實驗的基礎，藥物、基因功能、疾病機理等的相關研究多數需要在細胞水平進行闡釋。而細胞培養，受人員操作和環境條件的影響比較大，在細胞培養中常常會遇到很多的細節問題，而每個問題都有可能導致細胞培養的失敗。我們匯總了細胞實驗室多年來的細胞培養經驗分享給大家，希望能給大家的細胞培養帶來幫助。

一．細胞系身份需明確

 我們之所以選定某種細胞系開展實驗，是因為所選細胞系的一些特性符合研究方向的設定。比如組織特性，疾病特性，功能特性，基因表達特性等。一旦用錯了細胞株，對我們研究結果的判斷就會帶來很大的誤差和不確定性。

而近年來，多個機構發現細胞系在培養和流通過程中，出現了很嚴重的交叉污染。據不*統計，單就HeLa細胞系導致的污染致使3萬多篇論文結果的準確性存在問題（doi:10.1371/journal.pone.0186281）。而這種情況不僅僅限于HeLa細胞。多個機構研究人員檢測發現超過451個細胞系已被其它細胞*吸收，在所檢測細胞中污染占比46%，可見細胞交叉污染的現象非常普遍。因此，做實驗前對細胞株驗明正身非常重要。如果是在機構購買的細胞株，最好能讓供方提供合格的STR鑒定報告。

目前，STR基因分型方法是進行細胞交叉污染和性質鑒定的*和準確的方法之一，是ATCC等機構認定的金標準。不過可惜的是并非所有細胞均可進行STR鑒定，目前只有大部分的人源細胞株和45個種類的小鼠細胞株可以進行鑒定。其他細胞株可以結合細胞形態、特性和物種鑒定來進行確認。

二．培養、傳代、凍存和復蘇

1.準備工作：

根據培養細胞的特性，提前準備好適合的培養基和血清等。最好沿用細胞原來的培養條件，以免細胞在新環境下還需要過渡適應。同時，充分了解到細胞的生長特性和形態特征，便于后續的培養觀察。

2.貼壁細胞傳代：

1）移棄使用過的細胞培養液。（不要直接倒掉，避免瓶口殘留導致易污染）

2）使用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液（PBS）沖洗細胞。從與貼壁細胞層相對的容器一側輕輕加入沖洗液，以避免攪動細胞層，前后搖晃容器數次，最后移棄沖洗液。（洗去殘留的血清，避免影響胰酶的活性。）

3）以 25 cm2的培養瓶為例，向瓶內加入1ml胰蛋白酶-EDTA（請根據各細胞的指引使用合適的濃度）消化液，輕輕搖動培養瓶，使消化液流遍所有細胞表面，放到37 ℃ 孵育。通常，幾分鐘內，會發現胞質回縮、細胞間隙增大，傾斜培養瓶時細胞層能自然流下，此時應加入2-3ml含血清的*培養液終止消化（細胞解離所需時間請參考各細胞的指引，并建議每隔30秒在顯微鏡下觀察細胞的解離情況）。另外，并不是所有貼壁細胞都適用采用胰蛋白酶進行解離，請根據各細胞的指引選擇合適的解離方法。

4）使培養瓶傾斜，吸取培養瓶內液體輕輕沖向原細胞生長表面，重復該動作2-3次，使所有細胞沿瓶底流下，再輕柔地把細胞吹打成單個懸液（吹打過程中應避免氣泡的產生）。

PS：對于難消化的細胞，盡量不要通過用力吹打的方式來處理，以免對細胞產生物理損傷。可以先將已經消化的細胞分出來，及時終止消化。然后再對仍然貼壁的細胞進行再次消化。做到分層消化，避免易消化細胞長時間在胰酶消化下受損。

5）把所有的細胞懸液轉移到15ml離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘后移棄上清。

6）加入新的含血清*培養液重懸成單細胞懸液。按各細胞指引推薦的傳代比例，把細胞懸液均勻分到各培養器皿中，補足新的含血清*培養液，輕輕搖晃混勻。

7）放到37 ℃ 孵育，第二天顯微鏡下觀察細胞的貼壁情況。

3.懸浮細胞傳代：

因懸浮生長細胞不貼壁，故傳代時不必采用酶消化方法，而可直接傳代或離心收集細胞后傳代。

1）直接傳代時，靜置5-10分鐘，待懸浮細胞慢慢沉淀到器皿底部后，吸掉1/2-2/3原培養液，補足新鮮的含血清*培養液，混勻成細胞懸液。按各細胞指引推薦的傳代比例，把細胞懸液均勻分到各培養器皿中，輕輕搖晃混勻。

2）離心傳代時，將細胞連同培養液一并轉移到離心管內，800-1000rpm離心3-5分鐘，移棄上清后，加入新鮮的含血清*培養液重懸。按各細胞指引推薦的傳代比例，把細胞懸液均勻分到各培養器皿中，補足新鮮的含血清*培養液，輕輕搖晃混勻。

3）放到37 ℃ 孵育，第二天顯微鏡下觀察細胞的情況。

4.貼壁懸浮混合型細胞傳代：

先將懸浮的細胞收集，再參考“貼壁細胞傳代"方法進行消化收集，一起接種到培養器皿中。

PS: 懸浮細胞生長中一般對細胞密度要求比較高，培養中最好參考指南控制好細胞密度，不能過密也不能過稀。

5.細胞凍存：

1）按照“細胞傳代步驟"中的方法收集細胞。

2）加入細胞凍存液（一般10%DMSO+對應細胞的*培養液），使細胞的終密度為(5~10)×105個/ml，移入細胞凍存管中。

3）程序降溫（以使用需異丙醇的Nalgene程序降溫盒為例）：4℃ 30min→-80℃過夜→液氮。（一定不能省略4℃的30min，否則凍存液無法滲透到細胞，易產生冰晶導致細胞受損。）

6.細胞復蘇：

1）取出貯存的細胞，待液氮揮發后，馬上37℃水浴中輕輕搖動使快速融化（通常2min內，時間長了細胞狀態會受影響）。為避免劇烈的溫差變化導致凍存管炸裂，操作該步時請配戴防護面罩或防護目鏡。

PS：干冰運輸的凍存細胞，收到后需要立刻放入深低溫冰箱或液氮中，至少3d后再進行復蘇操作。

2）轉移到無菌操作臺，75%酒精擦拭凍存管外部。

3）將細胞懸液轉移到裝有10-20ml經預熱的含血清*培養液離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘，移棄上清。

4）重新加入經預熱的含血清*培養液重懸細胞，以約(3~5)×105個/ml密度接種到培養器皿中。

5）放到37℃孵育，第二天顯微鏡下觀察細胞的情況。

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大鼠 結膜成纖維細胞

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大鼠 牙周膜成纖維細胞

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大鼠 角膜內皮細胞

大鼠 鞏膜上皮細胞

大鼠 視網膜mulller細胞

大鼠 胎盤間充質干細胞

大鼠 胚胎成纖維細胞

綿羊肺成纖維細胞（原代永生化）

三.污染防治

1.細菌污染

細菌污染是細胞培養中最常見的污染，主要由操作不慎或使用了滅菌不*的耗材與試劑引入。最常見的有枯草桿菌、大腸桿菌、假單胞菌及白色葡萄球菌。鏡下形態則為長桿狀、短桿狀和顆粒狀等。

好氧菌增殖分裂迅速，感染24h內即可使培養基渾濁；厭氧菌在常規細胞培養條件下增殖緩慢，需要較長時間才會觀察到渾濁現象。

污染處理：由于國內細胞培養中抗生素使用泛濫，所以出現污染后加雙抗（青霉素&鏈霉素，Penicillin + Streptomycin）一般沒有效果。桿菌可選用100ug/ml慶大霉素處理一周，顆粒狀細菌可用25ug/ml環丙沙星處理一周，效果相對還不錯。

2. 真菌污染

細胞培養中最常見的污染真菌有：煙曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。

左邊這張是比較典型的霉菌污染的圖片，右圖是酵母污染，鏡下可以看到明顯的出芽形態。

污染處理：可用100ug兩性霉素/T25瓶，處理一周。

注：性較大，需要在細胞有50%以上且狀態沒受大影響前處理。