酶聯免疫吸附實驗 ELISA

    一．實驗目的
     酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay 簡稱ELISA）是在免疫酶技術（immunoenzymatic techniques）的基礎上發展起來的一種新型的免疫測定技術,ELISA過程包括抗原（抗體）吸附在固相載體上稱為包被，加待測抗體（抗原）, 再加相應酶標記抗體（抗原）,生成抗原（抗體）--待測抗體（抗原）--酶標記抗體的復合物，再與該酶的底物反應生成有色產物。借助分光光度計的光吸收計算抗體（抗原）的量。待測抗體（抗原）的定量與有色產生成正比。


    二．實驗原理
    用于免疫酶技術的酶有很多，如過氧化物酶，堿性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰膽堿酯酶，6－磷酸葡萄糖脫氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根過氧化物酶，堿性磷酸酯酶等，其中尤以辣根過氧化物酶為多。由于酶摧化的是氧化還原反應，在呈色后須立刻測定，否則空氣中的氧化作用使顏色加深，無法準確地定量。 
     辣根過氧化物酶（HRP）是一種糖蛋白，每個分子含有一個氯化血紅素（protonhemin）區作輔基。酶的濃度和純度常以輔基的含量表示。氯化血紅素輔基的大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的大吸收峰是275nm，所以酶的濃度和純度計算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分濃度為100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶濃度以 mg/ml 計算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP純度（RZ）=A403nm/A275nm純度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大說明酶內所含雜質越少。高純度HRP的RZ值在3.0左右，可達3.4。用于ELISA檢測的HRP的RZ值要求在3.0以上。 

   ELISA的基本原理有三條： 
    （1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學活性；
    （2）抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結合物，而此種酶結合物仍能保持其免疫學和酶學活性； 
    （3）酶結合物與相應抗原或抗體結合后，可根據加入底物的顏色反應來判定是否有免疫反應的存在，而且顏色反應的深淺是與標本中相應抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗結果。 
    ELISA法是免疫診斷中的一項新技術，現已成功地應用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據已經使用的結果，認為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩定及易于自動化操作等特點。不僅適用于臨床標本的檢查，而且由于一天之內可以檢查幾百甚至上千份標本,因此，也適合于血清流行病學調查。本法不僅可以用來測定抗體，而且也可用于測定體液中的循環抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫學各領域的應用范圍日益擴大，可概括四個方面： 1、免疫酶染色各種細胞內成份的定位。 2、研究抗酶抗體的合成。 3、顯現微量的免疫沉淀反應。 4、定量檢測體液中抗原或抗體成份。

基本方法一　用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法: 
　　1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。 
　　2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。 
　　3.　加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。 
　　4.　加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。 
　　5.　終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。 
　　6.　結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O•D值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零后測各孔O•D值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。 

基本方法二　用于檢測未知抗體的間接法： 
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml， 每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。 
↓ 
加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。（同時做空白、陰性及陽性孔對照） 
↓ 
于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,后一遍用DDW洗滌。 
↓ 
其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。 

     （二） 酶與底物
    酶結合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯劑作用下聯結的產物。是ELISA成敗的關鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應，還具有酶促反應，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物。
免疫技術常用的酶及其底物

酶        底物        顯色反應        測定波長
辣根過氧化物酶        鄰苯二胺        橘紅色        492*
        四甲替聯苯胺        黃色        460**
        氨基水楊酸        棕色        449
        鄰聯苯甲        蘭色        425
        2,2'-連胺基-2（3-乙基-并噻唑啉磺酸-6）銨鹽        藍綠色        642
堿性磷酸酯酶        4-硝基酚磷酸鹽（PNP）        黃色        400
        萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽        紅色        500
葡萄糖氧化酶        ABTS+HRP+葡萄糖        黃色        405,420
        葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭        深藍色        
β-Ｄ－半乳糖苷酶        甲基傘酮基半乳糖苷（4MuG）        熒光        360,450
        硝基酚半乳糖苷（ONPG）        黃色        420


     *  終止劑為2mol/L H2SO4
     ** 終止劑為2 mol/L檸檬酸， 不同的底物有不同的終止劑。
     可催化下列反應： HRP+H2O2→復合物 復合物+AH2→過氧化物酶+H2O+A AH2 ——為無色底物, 供氫體； A—— 為有色產物。

（三） ELISA常用的四種方法

    1．直接法測定抗原 
      將抗原吸附在載體表面；
      加酶標抗體，形成抗原—抗體復合物；
      加底物。底物的降解量＝抗原量。 

     2．間接法測定抗體
     將抗原吸附于固相載體表面；
      加抗體, 形成抗原-抗體復合物；
      加酶標抗體；
      加底物。 測定底物的降解量＝抗體量。

    3．雙抗體夾心法測定抗原
     將抗原免疫一種動物獲得的抗體吸附于固相表面;
     加抗原，形成抗原-抗體復合物; 
     加抗原免疫第二種動物獲得的抗體，形成抗體抗原抗體復合物;
     加酶標抗抗體（第二種動物抗體的抗體）; 
     加底物。底物的降解量＝抗原量。

    4. 競爭法測定抗原
    將抗體吸附在固相載體表面;
     （1） 加入酶標抗原；
     （2）,（3）加入酶標抗原和待測抗原；
     加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知抗原量。 

    三．儀器和材料

    1. 聚苯乙烯微量細胞培養板（平板, 40, 96孔）。
    2. 酶聯免疫檢測儀
    3. 辣根過氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀釋度1:1000。
    4. 包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸緩沖液,4℃，保存,　Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸餾水稀釋至100 ml。
     5. 稀釋液：0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20, ４℃，保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween—20，0.5ml. 蒸餾水加至1000ml。
     6. 洗滌液：同稀釋液
     7. 封閉液：0.5%雞卵清蛋白，pH7.4 PBS。
     8. 鄰苯二胺溶液（底物）：臨用前配制 0.1M 檸檬酸（2.1g/100ml）, 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O　（7.163g/100ml）　6.4ml, 蒸餾水12.5ml, 鄰苯二胺10mg, 溶解后, 臨用前加30%H2O2 40 微升。
     9. 終止液：2mol/LH2SO4。 

    四.  操作步驟
    1. 包被抗原：用包被液將抗原作適當稀釋, 一般為1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃溫育1小時后，4℃冰箱放置16～18小時。
    2. 洗滌：倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜放三分鐘，反復三次，后將反應板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡。
   3. 加封閉液200微升，37℃放置一小時。
   4. 洗滌同2。
   5. 加被檢血清：用稀釋液將被檢血清作幾種稀釋,，每孔200微升。同時作稀釋液對照。37℃放置2小時。
   6. 洗滌同2。
   7. 加辣根過氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小時。
   8. 洗滌同2。
   9. 加底物：鄰苯二胺溶液加200ml，室溫暗處10--15分鐘。
   10. 加終止液：每孔50微升。
   11. 觀察結果：用酶聯免疫檢測儀記錄490nm讀數。