細胞培養 | 貼壁細胞與懸浮細胞的凍存步驟及關鍵要點

在細胞運輸或長期不使用時，通常采用凍存方式進行保存。規范的細胞凍存操作直接影響后續復蘇效果，因此凍存流程的嚴謹性至關重要。

本期編者將系統介紹貼壁細胞與懸浮細胞的凍存步驟及注意事項，幫助大家完善操作細節。

凍存前的準備：可提前配制凍存液；若使用無血清非程序凍存液，則無需自行配制，也無需使用程序降溫盒。

一、貼壁細胞凍存步驟

1. 吸棄原有培養基，用PBS潤洗細胞；

2. 吸棄PBS，加入胰酶消化，消化完成后使用wan全培養基終止，并吹打均勻制成細胞懸液；

3. 以1200 rpm（約250g）離心3分鐘，che底吸棄上清，收集細胞沉淀；

4. 加入配制好的凍存液重懸細胞。一個長滿約80%的T25培養瓶可凍存1支，或按細胞計數以3~5×10? cells/支的密度凍存，每支凍存液用量建議為0.5~1 mL；

5. 分裝至凍存管，擰緊管蓋并做好標記；

6. 將凍存管置于程序降溫盒中，于-80℃冰箱過夜；

7. 最后轉移至液氮中長期保存。

二、懸浮細胞凍存步驟

1. 將細胞懸液直接以1200 rpm（約250g）離心3分鐘，盡量吸棄上清，收集細胞沉淀；

2. 用配制好的凍存液重懸細胞。一個傳代密度的T25培養瓶可凍存1支，或按細胞計數以3~5×10? cells/支的密度凍存，每支推薦使用0.5~1 mL凍存液；

3. 分裝至凍存管，擰緊管蓋并清晰標記；

4. 置于程序降溫盒中，放入-80℃冰箱過夜；

5. 隨后轉移至液氮長期保存。

三、注意事項

1. 凍存液應提前配制，避免將DMSO直接加入細胞懸液；

2. 宜選擇處于對數生長期、匯合度約80%–90%的細胞進行凍存，具體凍存密度可根據細胞特性調整；

3. 程序凍存盒、凍存液和wan全培養基等需恢復至室溫再使用；

4. 凍存過程中應避免消化時間過長、吹打過猛、離心轉速過高或時間過長，以防細胞損傷；

5. 細胞長期保存應置于液氮中，不建議在-80℃條件下長期存放；

6. 若無程序降溫盒，可依次按以下步驟降溫：室溫→4℃（20分鐘）→-20℃（30分鐘）→-80℃過夜→液氮保存，轉移過程中需注意保冷，防止溫度波動或凍存管融化。