原代細胞培養注意事項

錯誤1：

一小管原代細胞在水浴中解凍一段時間。

糾正1：

原代細胞對解凍過程非常敏感，因此將小瓶置于37℃水浴中，保持并輕輕旋轉直到內容物剛剛解凍是很重要的。然后應立即從水浴中取出小瓶，并轉移到無菌操作臺。確保您的培養瓶在解凍前已經準備就緒，以便可以立即用于接種細胞，并置于培養箱中。

錯誤2：

解凍match小瓶后直接離心原代細胞。

糾正2：

我們不建議在解凍后離心細胞，因為離心程序比少量的DMSO殘留更有害。記住，在恢復原代細胞后的第二天更換培養基以去除任何殘留的DMSO。

錯誤3：

允許原代細胞變得過于融合。

糾正3：

當生長至100％匯合時，原代細胞可以變得衰老。記住，原代細胞不是100％純，因此重要的是盡量減少污染細胞的生長。我們建議在細胞達到90-95％融合時，對原代細胞進行傳代培養。

錯誤4：

傳代原代細胞時過度胰蛋白酶消化。

糾正4：

當細胞傳代時，使用低濃度的胰蛋白酶并在顯微鏡下密切監測細胞。此外，記得在胰蛋白酶消化后中和細胞中的胰酶，因為任何活性的胰蛋白酶都將損傷細胞。

錯誤5：

原代細胞可以很容易地重新凍存。

糾正5：

通常我們不推薦重新凍存原代細胞，因為這可以促進細胞衰老和/或導致功能變化。原代細胞非常敏感，重新凍結可能導致細胞死亡或損傷。

錯誤6：

原代細胞可以無限的增殖。

糾正6：

與細胞系不同，原代細胞具有有限的擴增能力。我們建議盡早使用原代細胞進行實驗以防止遺傳漂移。此外，如果你正在使用一個增值困難的細胞類型，你應該密切監測細胞形態，因為少量混雜的細胞（如成纖維細胞）可能隨著時間的推移，大量生長從而成為主要細胞。

錯誤糾正后就該步入正軌啦——

應如何進行凍存細胞的培養？

下列步驟以單管凍存細胞進行培養的實驗方案為例。

● 準備一燒杯37°C的水。

● 從液氮儲存中取出一管細胞，注意保護手和眼睛。

● 擰松管蓋1/4圈，等待10秒鐘以釋放螺紋中可能殘留的液氮，再重新擰緊管蓋。

● 將凍存管的下半部分置于37°C水浴中進行解凍，直至凍存管內僅剩余一小塊冰芯，使細胞迅速解凍。

● 用消毒液擦拭管體外表面，再將其移至II級A型層流細胞培養通風櫥中。

● 打開管蓋，使用1 mL移液器上下吹打細胞懸液以分散細胞。

                                                          臺盼藍染色

● 從管中吸取20 uL細胞懸液，并將其稀釋于20 uL臺盼藍溶液中。

● 使用血細胞計數板來確定每毫升懸液中的活細胞數。

● 將管中懸液（1 mL）稀釋至產品說明中的推薦濃度。

● 將5 mL細胞懸液加入25 cm2培養瓶，或將15 mL細胞懸浮液加入75cm2培養瓶中。

● 搖勻培養瓶中的培養基以分散細胞。許多類型的細胞都會迅速貼壁，如果沒有在傳代后即刻搖勻細胞，細胞可能生長不均勻。

● 在37°C、5% CO2/95%空氣、濕度細胞培養箱中培養細胞。為了獲得最佳結果，培養開始后至少在24小時之內不要擾動細胞。

是否可以對擴增后的細胞重新凍存？如果可以該如何操作？

當從細胞庫購買的凍存或正處于增殖期的細胞，可對其進行擴增和重新凍存。不過，凍存操作可能會對細胞的生長狀態有所影響。下列實驗方案為大家提供了一份使用無蛋白成份的凍存培養基凍存細胞的基礎指南。

請注意：由于凍存設備與個人技術之間的差異，我們無法確保使用本方案凍存的細胞在復蘇后能夠保持活力，我們也無法為研究用戶實驗室凍存細胞的效果進行擔保。

● 使用37°C水浴化凍無蛋白成份的凍存培養基或4°C條件下過夜化凍。

● 如果在水浴中進行化凍，請確保溫度不要超過37°C，也勿將該產品延長時間置于37°C。

● 無蛋白成份的凍存培養基在使用前應置于4°C條件下平衡。為獲得優結果，推薦大家使用能夠控制變溫速率的冰箱。如果缺少能夠控制變溫速率的冰箱，也可使用細胞凍存盒。

● 如需用酶試劑解離培養器皿表面的細胞，則需使用對應的終止溶液重懸細胞以中和酶的效果。

● 通過離心沉淀細胞。

● 去除上清液后，使用預冷的無蛋白成份的凍存培養基以5x10E5至3x10E6細胞/毫升的密度重懸細胞。

● 將細胞懸液分裝至合適數量的凍存管中。

● 將細胞盡快冷卻至4°C。

● 如果使用控制變溫速率的冰箱：以每分鐘降低1°C的速率冰凍樣品，直至–40°C。之后按照每分鐘降低2°C的速率降至–90°C左右。

● 如果使用細胞凍存盒：請按照說明書來準備凍存盒。

● 為獲得最佳結果，推薦大家在細胞溫度降至–80°C后，盡快將凍存管轉移至液氮儲存設備的氣相中。

● 作為無蛋白成份的凍存培養基的替代品，可使用該凍存細胞推薦的基礎培養基，添加10%胎牛血清（FBS）和10% DMSO進行細胞凍存。 

組織塊貼壁法分離細胞時：注意組織塊貼壁2-3h后，補液時沿壁輕輕加入培養基，防止組織塊漂浮。

特別提醒：

如果用血清培養原代細胞，那么需要用到更高級別的胎牛血清，特級胎牛血清，

千舍推薦：WinSera FBS500-WP-002、PAN ST30-2602、BOVOGEN 新西蘭SFBS