COLO320-GFP-puro(GHRLOS過表達)細胞

支原體污染一直是細胞培養(yǎng)的“頭號敵人”，但是支原體的存在卻十分普遍，它的“不請自來”總是讓我們措手不及。世界上有近60%的實驗室正在遭受支原體污染的困擾，今天就讓我們來好好認識這個“刺頭”吧！

什么是支原體？

支原體結(jié)構(gòu)簡單，具有高度多形性、無細胞壁、增殖緩慢、可在人工培養(yǎng)基中存活并增殖的特點。除此之外，它的“個頭”很小，只有0.1-0.3um，可通過一般的濾菌器。支原體主要以二分裂方式繁殖，亦可以出芽方式繁殖，分枝形成絲狀后斷裂呈球桿狀顆粒。大部分支原體繁殖速度比細菌慢，適宜生長溫度為35℃，最適pH值為7.8～8.0。在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，形成典型的“荷包蛋”狀菌落。

支原體是如何欺負細胞的？

我們知道一株被支原體污染的細胞是無法用來做實驗得出準確的實驗數(shù)據(jù)的--一方面是因為支原體本身也是一種原核細胞生物，相當于一種交叉污染；另一方面，細胞感染支原體后，由于支原體大量消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)和細胞代謝的基礎成分，包括核酸前體、氨基酸、維生素、脂質(zhì)、膽固醇等，導致細胞增殖緩慢及各種代謝、功能紊亂甚至喪失；除此之外，支原體還會吸附在細胞表面，破壞細胞膜的完整性，更有少數(shù)類型支原體可進入細胞內(nèi)，如發(fā)酵支原體、生殖支原體和肺炎支原體。

如何確診細胞支原體污染？

支原體污染之所以讓廣大科研人員頭疼，是因為它在普通光學顯微鏡下難以被發(fā)現(xiàn)，并且細胞被污染早期不會表現(xiàn)出明顯的“癥狀”。

一般來說，如果培養(yǎng)過程中細胞增殖突然變慢，培養(yǎng)基中黑點、碎片明顯增多，培養(yǎng)基PH變化（變黃）周期變短，那么細胞很可能已經(jīng)感染了支原體。這時候，就需要使用各種檢測手段來確認。目前常用的方法有：DNA染色法，支原體培養(yǎng)法，PCR法（包括凝膠電泳和熒光定量），化學發(fā)光法。前兩種方法結(jié)果可靠，但實驗周期長。PCR法原理是在支原體16S rRNA基因的保守區(qū)設計引物，通過檢測支原體DNA來檢測細胞中有無支原體的污染，得到的廣泛應用。

細胞確診支原體污染后，怎么辦？

如果您的細胞不幸感染了支原體，好的處理方式是立即丟棄該細胞，并對培養(yǎng)箱、超凈臺等設施及場所進行消毒滅菌。因為支原體的傳播非常隱秘，相關研究表明其甚至能通過氣溶膠傳播。當然，如果您的細胞非常珍貴或者不能再獲得，可以嘗試使用抑制支原體的藥物進行處理，嘗試消除支原體污染。能抑制支原體的藥物有四環(huán)素；大環(huán)內(nèi)酯類藥物，如羅紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素等；喹諾酮類藥物，如氧氟沙星、司帕沙星等。

這個過程一般周期較長，因為使用藥物處理時需配合多次大比例連續(xù)傳代來提高成功率。堅持，就是勝利！

傳代培養(yǎng)及其操作步驟

原代細胞培養(yǎng)成功以后，需要進行分離培養(yǎng)，否則細胞會因生存空間不足或密度過大，營養(yǎng)障礙，影響細胞生長。細胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過程稱之為傳代培養(yǎng)。傳代細胞允許培養(yǎng)的細胞擴增(形成細胞株)，可以進行細胞克隆，易于保存，但可能喪失一些特殊的細胞和分化特征。傳代細胞形成細胞株的最大利處在于提供了大量持久的實驗材料，便于實驗。

1、操作步驟：

（1）吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。

（2）向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。

（3）置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進行消化，2~5min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大后，應立即中止消化。

（4）吸出消化液，向瓶內(nèi)加入Hanks液少量，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，把殘留消化液沖掉，然后再加培養(yǎng)液。如果僅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培養(yǎng)液，終止消化。

（5）使用彎頭吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細胞。

（6）用計數(shù)板計數(shù)后，分別接種于新的培養(yǎng)瓶中，置CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

（7）細胞培養(yǎng)換液時間應根據(jù)細胞生長的狀態(tài)和實驗要求來確定。一般2～3d后應換一次生長液。待細胞鋪滿器皿底面，即可使用；也可繼續(xù)傳代擴大培養(yǎng)或換成維持液。

2、注意事項：

（1）掌握好細胞消化的時間，消化時間過短時，細胞不宜從瓶壁脫落，過長的消化會導致細胞脫落、損傷。

（2）掌握好消化濃度，當消化液濃度過高時，消化時間應縮短，過低時細胞消化時間相對延長。

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